32通道移液工作站在禽流感檢測(cè)血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI實(shí)驗(yàn))中的應(yīng)用

        方 案 摘 要    

禽流感病毒（AIV）屬甲型流感病毒。流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3個(gè)型。其中甲型流感病毒多發(fā)于禽類，一些甲型也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動(dòng)物及人類；乙型和丙型流感病毒則分別見(jiàn)于海豹和豬的感染。

在禽流感防控領(lǐng)域，血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI實(shí)驗(yàn)）作為血清學(xué)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，其檢測(cè)效率與準(zhǔn)確性直接關(guān)系到疫情監(jiān)測(cè)和疫苗評(píng)價(jià)的質(zhì)量。傳統(tǒng)手工操作面臨通量低、重復(fù)性差等瓶頸，32通道移液工作站含4個(gè)并排的8通道移液頭，是傳統(tǒng)的8道移液槍的4倍，通過(guò)高通量的自動(dòng)化移液技術(shù)重塑實(shí)驗(yàn)室工作流程，顯著提升HI實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化水平與檢測(cè)能力。

          方 案 詳 情      

   一.實(shí)驗(yàn)原理          

 ?HI實(shí)驗(yàn)又叫血凝抑制實(shí)驗(yàn)。?是通過(guò)利用特異性抗體抑制血凝現(xiàn)象，從而檢測(cè)血清中的抗體滴度的一種方法。

二.實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備             

1、設(shè)備和材料

① fluidot 32道移液工作站FDT-8*4-16或FDT-8*4-28

② 96孔血凝板 ICF-PS-96V-S

③血凝/血凝抑制實(shí)驗(yàn)分析儀

2、試劑和材料

① 阿氏(Alsevers)液。

② 21%(體積分?jǐn)?shù))雞紅細(xì)胞懸液。

③ pH 7.2、0.01 mol/L PBS。

④ AIV HA 分型參考抗原、參考陽(yáng)性血清、陰性血清。

  三.實(shí)驗(yàn)步驟          

1、工作站自動(dòng)取32個(gè)吸頭，在 96孔V形微量反應(yīng)板中，1-11列加25μL PBS，12列加50μL PBS

2、雞血清不需要處理，可直接進(jìn)行檢測(cè)；若為水禽或奶牛等血清，建議將血清進(jìn)行預(yù)處理。取32個(gè)吸頭，第1列加 25μL血清，自動(dòng)吹吸混勻。

3、與PBS充分混勻后吸25μL于第2行；若血清經(jīng)過(guò)預(yù)處理，第1列不加PBS，直接加處理過(guò)的血清25μL，第2列加入處理過(guò)的血清25μL，與 PBS充分混勻后吸25 μL于第3孔。依次2倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μL，棄去，第 11 孔作為抗原對(duì)照。單獨(dú)設(shè)立兩行對(duì)照，一行加陽(yáng)性血清，一行加陰性血清。

4、取32個(gè)吸頭，第1列~第11列等量加入25μL 4HAU抗原，在室溫(約 20 ℃)下靜置 30 min或4 ℃ 60 min。

5、取32個(gè)吸頭，每孔加入25 μL, 1%(體積分?jǐn)?shù))雞紅細(xì)胞懸液，自動(dòng)混勻后棄去吸頭，在室溫(約 20 ℃)下靜置 40 min 或4℃ 60 min，空白對(duì)照孔(12 孔)紅細(xì)胞呈顯著紐扣狀時(shí)判定結(jié)果。

   四、結(jié)果判定   

1、 當(dāng)抗原/病毒對(duì)照孔(第 11孔)完全凝集，且陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)不高于 1:4，陽(yáng)性對(duì)照血清抗體效價(jià)與已知效價(jià)誤差不超過(guò)1個(gè)滴度時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果方可成立。以完全抑制4HAU 抗原/病毒的最高血清稀釋倍數(shù)判為該血清的HI抗體效價(jià)。

2、 用于檢測(cè)抗原/病毒時(shí)，能夠被某亞型 AIV參考陽(yáng)性血清特異性抑制，H抗體效價(jià)≥1:16時(shí)判定為該亞型 AIV 陽(yáng)性；1:2≤H抗體效價(jià)<1:8判為該亞型 AIV 疑似，應(yīng)結(jié)合其他病毒檢測(cè)方法進(jìn)行鑒定；無(wú)HI抗體效價(jià)判為該亞型AI 陰性。

3、 用于檢測(cè)抗體/血清時(shí)，免疫禽 H抗體效價(jià)≤1:8判為陰性，HI抗體效價(jià)>1:16判為陽(yáng)性。

 4、 若血清進(jìn)行了預(yù)處理，當(dāng)抗原/病毒對(duì)照孔(第 11孔)完全凝集，且陰性對(duì)照血清抗體效價(jià)<1:10，陽(yáng)性對(duì)照血清抗體效價(jià)與已知效價(jià)誤差不超過(guò)1個(gè)滴度時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果方可成立。以完全抑制4hau抗原>1:20時(shí)判定為陽(yáng)性;

血清抗體效價(jià)<1:10判為陰性；用于檢測(cè)免疫水禽抗體/血清時(shí)，血清H抗體效價(jià)<1:10判為陰性，血清hi抗體效價(jià)>1:10判為陽(yáng)性；用于未免疫水禽或哺乳動(dòng)物感染病毒診斷依據(jù)時(shí)，HI抗體效價(jià)≥1:20判為陽(yáng)性。