Pipetty電動移液器在尼帕病毒檢測（實時熒光定量RT-PCR)中的應用

摘要：根據國家疾控中心相關的尼帕病毒實驗室檢測技術方案，旨在提供Pipetty電動移液器在尼帕病毒實時熒光定量RT-PCR檢測中的具體應用，結合核酸提取、RT-PCR反應體系配制、擴增檢測等核心實驗環節，發揮其精準微量移液、高效操作、防交叉污染的優勢，規范實驗操作步驟，保障尼帕病毒核酸檢測結果的準確性、重復性和可靠性，為實驗室開展尼帕病毒快速篩查與確診提供標準化技術支撐。

方案詳情：

一、實驗原理

尼帕病毒屬于單股負鏈RNA病毒，實時熒光定量RT-PCR（Realtime RT-PCR）技術是檢測該病毒的核心方法，其原理是先通過反轉錄酶將病毒RNA逆轉錄為cDNA，再以cDNA為模板，利用尼帕病毒特異性上游引物、下游引物與熒光探針，在Taq酶作用下進行PCR擴增。擴增過程中，熒光探針與目的片段特異性結合，隨著擴增循環的進行，熒光信號不斷累積，通過儀器實時監測熒光強度，可實現對尼帕病毒核酸的定性判斷和定量分析。

二、?實驗準備

1、設配和材料

① Pipetty電動移液器MSIC01-03-20，MSIC01-03-250；

② 核酸提取儀；

③ PCR擴增儀；

④ 生物安全柜；

⑤ 水浴鍋；

⑥ 冰箱和冰柜；

⑦ 離心機。

2、試劑和材料

① 上游引物TCA-GCA-GGA-AGG-CAA-GAG-AGT-AA；

下游引物CCC-CTT-CAT-CGA-TAT-CTT-GAT-CA；

熒光探針FAM-CCT-CCA-ATG-AGC-ACA-CCT-CCT-GCA-G-TAMRA；

② RT-PCR試劑盒；

③ 陰性對照；

④ 陽性對照；

⑤ 無核酶水；

⑥ RNA提取試劑。

三、實驗步驟

1、將待測樣本（如血液、腦脊液、尿液等）在生物安全柜中進行預處理。

2、反應條件根據實驗室具體使用的商業化 Realtime RT-PCR試劑盒為準，以QIAGEN公司OneStepRT-PCR試劑盒為例。核酸擴增檢測的反應體系如下：

3、反應體系

注：每次檢測均需配制陽性對照和陰性對照作為實驗室檢測質控。

4、使用Pipetty電動移液器根據預設的熒光PCR反應體系表，設置單次分液模式；先計算所需總孔數，將除待測樣本之外的所有試劑按對應體積計算后，額外增加10%的試劑體積，精準移取至同一離心管中，開啟移液器混勻模式，將試劑自動混勻。

5、將Pipetty電動移液器切換至連續分液模式，根據單孔反應體系體積，精準吸取混合好的試劑，分別加入到96孔PCR板的對應孔中。再用移液器精準吸取對應體積的待測樣本，加入到對應孔中，將96孔板放入高速離心機，離心。

6、反應程序設置（按照實時熒光定量PCR擴增儀說明書操作）：

 反轉錄階段：50℃，30分鐘；95℃，15分鐘（無循環，完成反轉錄及酶激活）；

擴增階段：95℃，30秒（變性）；55℃，30秒（退火）；72℃，60秒（延伸），讀取熒光信號，共40個循環；

擴增結束后，儀器自動生成擴增曲線和Ct值，用于結果判定。

四、結果判定

1、尼帕病毒核酸實時熒光定量RT-PCR 方法實驗室檢測有效性判讀條件:

(1)陽性對照Ct值<35;

(2)陰性對照無Ct值(無擴增曲線)。同時滿足上述兩個條件，實驗室檢測結果有效;上述任一條件不滿足，實驗室檢測結果無效。

2、待測標本核酸實驗室檢測結果判讀:

(1)待測標本Ct值<35，標本為尼帕病毒陽性;

(2)待測標本Ct值>38，標本為尼帕病毒陰性;

(3)待測標本Ct值≥35且Ct值≤38，標本需要再次提取核酸進行復核檢測。